# 변이 탐지 (Variant Calling)

## 1. 개요
**변이 탐지(Variant Calling)**란 차세대 염기서열 분석(NGS, Next-Generation Sequencing)을 통해 얻은 샘플의 염기서열 데이터를 표준 참조 유전체(Reference Genome)와 비교하여, 염기서열의 차이가 발생하는 지점을 식별하고 그 유형을 결정하는 생물정보학적 분석 과정을 말한다.

이 과정의 핵심 목적은 개체 간의 유전적 다양성을 파악하거나, 특정 질병과 연관된 돌연변이를 찾아내어 진단 및 치료에 활용하는 것이다. 분석가는 샘플에서 읽어낸 수많은 짧은 서열(Reads)을 참조 유전체에 정렬한 뒤, 통계적 모델을 사용하여 해당 위치의 차이가 단순한 시퀀싱 오류(Sequencing Error)인지 실제 생물학적 변이인지를 판별한다.

## 2. 변이의 종류
유전적 변이는 그 크기와 형태에 따라 다양하게 분류되며, 각각의 변이는 단백질 구조 변경이나 유전자 발현 조절에 서로 다른 영향을 미친다.

| 변이 유형 | 풀네임 | 정의 | 크기 | 생물학적 의미 및 예시 |
| :--- | :--- | :--- | :--- | :--- |
| **SNV** | Single Nucleotide Variant | 단일 염기 하나가 다른 염기로 바뀐 변이 | 1 bp | 점 돌연변이(Point Mutation), 아미노산 변경 유발 가능 |
| **Indel** | Insertion/Deletion | 짧은 염기서열의 삽입 또는 결실 | $\le$ 50 bp | 프레임시프트(Frameshift) 발생 시 단백질 기능 상실 가능성 높음 |
| **CNV** | Copy Number Variation | 특정 유전자 구간의 복제수 변화 | $\ge$ 1 kb | 유전자 증폭 또는 결실, 암 유전자(Oncogene) 활성화와 관련 |
| **SV** | Structural Variant | CNV를 포함한 대규모 구조적 재배열 | $\ge$ 50 bp | 전좌(Translocation), 역위(Inversion), 중복(Duplication) 등 대규모 유전체 변화 |

## 3. 변이 탐지 파이프라인 (Workflow)
Raw Data로부터 최종 변이 리스트를 도출하기까지의 과정은 일반적으로 다음과 같은 표준 파이프라인을 따른다.

**[데이터 흐름도]**
`FASTQ (Raw Reads)` $\rightarrow$ `BWA/Bowtie2 (Alignment)` $\rightarrow$ `SAM` $\rightarrow$ `BAM (Binary Alignment Map)` $\rightarrow$ `Picard/Samtools (Preprocessing)` $\rightarrow$ `GATK/FreeBayes (Variant Calling)` $\rightarrow$ `VCF (Variant Call Format)`

### 단계별 상세 설명
1. **전처리 (Preprocessing):** 시퀀싱 장비에서 생성된 FASTQ 파일의 품질을 점검하고, 어댑터 서열 제거 및 저품질 염기를 트리밍(Trimming)한다.
2. **정렬 (Alignment/Mapping):** 짧은 리드(Reads)들을 참조 유전체의 어느 위치에 해당하는지 찾아 매핑한다. 주로 BWA(Burrows-Wheeler Aligner)가 사용된다.
3. **파일 변환 (SAM $\rightarrow$ BAM):** 용량 효율성과 처리 속도를 위해 텍스트 형식의 SAM(Sequence Alignment Map) 파일을 이진 형식인 BAM으로 변환한다.
4. **중복 제거 (Mark Duplicates):** PCR 증폭 과정에서 발생한 중복 리드(Duplicate Reads)를 식별하여 제거함으로써, 특정 리드가 과하게 계산되어 변이로 오인되는 것을 방지한다.
5. **염기 재교정 (Base Quality Score Recalibration, BQSR):** 시퀀싱 기기 특유의 체계적 오류를 보정하여 염기 품질 점수(Quality Score)의 정확도를 높인다.
6. **변이 호출 (Variant Calling):** 정렬된 데이터를 바탕으로 참조 유전체와 다른 지점을 찾아 변이 유형과 유전자형(Genotype)을 결정한다.

## 4. 변이 탐지 원리 및 알고리즘
변이 탐지 도구들은 단순한 일치 여부를 넘어, 통계적 확률을 통해 변이의 신뢰도를 계산한다.

### 4.1 확률 모델 기반 Bayesian 접근법
베이지안 추론은 사전 확률(Prior probability)과 데이터로부터 얻은 우도(Likelihood)를 결합하여 사후 확률(Posterior probability)을 계산한다.
- **원리:** 특정 위치의 염기가 변이일 확률 $P(Genotype | Data)$을 계산하여, 임계값 이상의 확률을 가진 경우에만 변이로 호출한다.
- **특징:** 리드의 깊이(Depth)와 염기 품질 점수를 함께 고려하므로 노이즈에 강하다.

### 4.2 De Bruijn Graph 기반 Local Assembly
정렬(Alignment) 과정에서 Indel이나 SV가 포함된 리드는 참조 유전체와 일치하지 않아 매핑 품질이 떨어진다.
- **원리:** 변이가 의심되는 영역의 리드들을 모두 모아 $k$-mer(길이가 $k$인 부분 문자열) 단위로 쪼개고, 이를 그래프 형태로 재조립(Assembly)하여 실제 서열을 복원한다.
- **특징:** 정렬 오류로 인한 위양성을 줄이고, 복잡한 Indel 탐지 성능을 획기적으로 높인다. (예: GATK HaplotypeCaller)

## 5. 분석 목적별 차이: Germline vs Somatic
변이 탐지는 분석 대상이 되는 세포의 성격에 따라 접근 방식이 완전히 다르다.

| 구분 | 생식세포 변이 (Germline) | 체세포 변이 (Somatic) |
| :--- | :--- | :--- |
| **정의** | 부모로부터 물려받아 모든 세포에 존재하는 변이 | 특정 세포(예: 암세포)에서 후천적으로 발생한 변이 |
| **비교 대상** | 샘플 $\leftrightarrow$ 참조 유전체 | 종양 샘플 $\leftrightarrow$ 정상 샘플 (Matched Normal) |
| **기대 대립유전자 빈도 (VAF)** | 주로 50%(이형접합) 또는 100%(동형접합) | 종양 샘플 내 암세포의 순도(Purity)와 클론성(Clonality)에 따라 VAF가 매우 낮게 나타날 수 있음 |
| **분석 난이도** | 상대적으로 낮음 | 매우 높음 (낮은 VAF의 변이를 노이즈와 구분해야 함) |

**[VAF 계산식]**
$$\text{VAF (Variant Allele Frequency)} = \frac{\text{Number of reads supporting the variant allele}}{\text{Total number of reads covering the position (Depth)}}$$

## 6. 주요 도구 및 소프트웨어
분석 목적과 데이터의 특성에 따라 적절한 도구를 선택해야 한다.

| 도구 | 주요 알고리즘 | 장점 | 주요 용도 |
| :--- | :--- | :--- | :--- |
| [**GATK**](https://gatk.broadinstitute.org/) | HaplotypeCaller (Local Assembly) | 업계 표준, 높은 정확도, 정교한 필터링 | Germline SNV/Indel |
| [**Mutect2**](https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035531092-Mutect2) | Bayesian / Local Assembly | Somatic 변이 탐지 최적화, 낮은 VAF 탐지 가능 | Somatic SNV/Indel |
| [**FreeBayes**](https://github.com/freebayes/freebayes) | Bayesian (Haplotype-based) | 참조 유전체 없이도 분석 가능, 다배체 분석 강점 | 일반 변이 탐지 |
| [**Samtools**](http://www.htslib.org/) | Pileup-based (Heuristic) | 매우 빠른 처리 속도, 낮은 메모리 사용량 | 빠른 스크리닝 |
| [**DeepVariant**](https://github.com/google-deepmind/deepvariant) | CNN (Deep Learning) | 이미지 인식 기반으로 오류 패턴 학습, 최고 수준의 정확도 | 고정밀 변이 탐지 |

## 7. 결과 분석 및 필터링 (Variant Filtering)
변이 탐지 결과에는 시퀀싱 오류나 매핑 오류로 인한 **위양성(False Positive)**이 포함되어 있다. 이를 제거하기 위해 품질 지표를 기반으로 필터링을 수행한다.

### 7.1 주요 품질 지표
- **Depth (DP):** 해당 위치를 덮고 있는 리드의 총 개수. 너무 낮으면 신뢰도가 떨어지고, 너무 높으면 반복 서열(Repeat)일 가능성이 크다.
- **Genotype Quality (GQ):** 결정된 유전자형이 정답일 확률을 나타내는 점수.
- **Qual (Quality Score):** 해당 위치에 변이가 존재할 확률에 로그를 취한 값.

### 7.2 필터링 전략 및 코드 예시
최근에는 하드 필터링(Hard Filtering) 외에도 머신러닝 기반의 VQSR(Variant Quality Score Recalibration)이 사용된다.

**[bcftools를 이용한 하드 필터링 예시]**
```bash
# DP(깊이)가 10 이상이고, QUAL(품질점수)이 30 이상인 변이만 추출
bcftools filter -i 'QUAL>=30 && DP>=10' input.vcf -o filtered.vcf
```

**[GATK를 이용한 필터링 예시]**
```bash
# 특정 기준(QD < 2.0 등)을 만족하는 변이에 'Filter' 태그 부여
gatk VariantFiltration \
   -V input.vcf \
   -filter "QD < 2.0" --filter-name "low-QD" \
   -O filtered.vcf
```

## 8. VCF 파일 형식 및 정확도 평가

### 8.1 VCF (Variant Call Format) 구조
VCF는 변이 정보를 저장하는 표준 텍스트 파일로, 크게 헤더(Header)와 데이터(Data) 영역으로 나뉜다.

**데이터 필드 상세 구성:**
| 필드명 | 설명 | 비고 |
| :--- | :--- | :--- |
| **CHROM** | 염색체 번호 | 예: chr1, chrX |
| **POS** | 변이가 발생한 위치 | 1-based coordinate (주의: BED 파일 등 일부 형식은 0-based를 사용하므로 분석 시 좌표 변환에 유의해야 함) |
| **ID** | 변이의 고유 식별자 | 예: rsID (dbSNP) |
| **REF** | 참조 유전체의 염기 | Reference allele |
| **ALT** | 샘플에서 발견된 변이 염기 | Alternative allele |
| **QUAL** | 변이 호출의 품질 점수 | Phred-scaled quality score |
| **FILTER** | 필터 통과 여부 | `PASS` 또는 필터 이름 |
| **INFO** | 변이에 대한 추가 정보 | DP, AF 등 전역 정보 |
| **FORMAT** | 샘플 정보의 형식 정의 | GT, DP, AD 등 |
| **SAMPLE** | 개별 샘플의 실제 값 | 유전자형(GT) 등 상세 정보 |

### 8.2 변이 탐지 정확도 평가 지표
탐지된 변이가 실제 정답(Truth set)과 얼마나 일치하는지를 평가하기 위해 다음 지표를 사용한다.

- **정밀도 (Precision):** 변이로 호출된 것 중 실제 변이인 비율
  $$\text{Precision} = \frac{TP}{TP + FP}$$
- **재현율 (Recall/Sensitivity):** 실제 존재하는 변이 중 성공적으로 찾아낸 비율
  $$\text{Recall} = \frac{TP}{TP + FN}$$
- **F1-Score:** 정밀도와 재현율의 조화 평균으로, 전체적인 성능을 하나의 수치로 나타낸다.

*(TP: True Positive, FP: False Positive, FN: False Negative)*